Avatud antikehade projekt on ülemaailmne teaduskoostöö, mida edendavad ühiselt UC Davis, NIH NeuroMab Facility, DSHB ja Addgene. Selle eesmärk on käsitleda antikehade reprodutseeritavuse kriisi standardimise, läbipaistvuse ja avatud jagamise kaudu. Selle juurutamine ei ole lahtine algatus, vaid kuue{2}}astmeline projekteerimisprotsess, mis on käivitatav, auditeeritav ja reprodutseeritav.
1. Antikehade geenijärjestuste standardiseeritud omandamine ja esitamine
Allikas: antigeen{0}}spetsiifilised B-rakud eraldatakse immuniseeritud loomadelt või taastunud patsientidelt üksikute B-rakkude sorteerimistehnoloogia (nt FACS) abil. BCR mRNA ekstraheeritakse ja amplifitseeritakse RT-PCR abil, et saada raskete ja kergete ahelate täielikud V(D)J järjestused.
Vormingunõuded: järjestus peab olema FASTA-vormingus ja sisaldama V-, D- ja J-geenifragmentide märkusi.
Lisada tuleb teave immunogeeni kohta (antigeeni nimi, liik, immuniseerimisprotseduur).
Tuleb märkida kloonimise päritolu (nt "inimdoonor nr 27, pärast-SARS-CoV-2 infektsioon").
Esitamisplatvorm: esitage töötlemata järjestuse andmed Addgene'i vormi "Soovitage plasmiidi" kaudu.
Põhipunktid: järjestus peab olema rekombinantse antikeha geen; hübridoomidest pärinevate sekveneerimata antikehade esitamine on keelatud.
2. Plasmiidi ehitus ja konstrueeritud ekspressioonivektori koost
Vektori valik: kasutage standardseid imetajate ekspressioonivektoreid (nt pCMV või pEF1), tagades IgG1 Fc konstantse piirkonna ja Kozaki järjestuse kaasamise.
Kloonimismeetod: kasutage Gibsoni komplekti või Golden Gate'i kloonimist, et saavutada raskete ja kergete ahelate loomulik sidumine, vältides juhuslikke kombinatsioone.
Plasmiidide nimetamise kokkulepped:
OpenAb_[Antigeen]_[Liik]_[Klooni ID]_v1
Näide: OpenAb_SARS2_Spike_hu_047_v1
3. Esitamine ja ülevaatamine Addgene platvormi kaudu
Esitamise kirje: pääsete juurde vormile Addgene Suggest a Plasmid
Läbivaatamise kriteeriumid: järjestus vaba saastumisest ja kaadrinihke mutatsioonidest; Plasmiid sisaldab täielikku promootorit ja terminaatorit; Esitage plasmiidikaart (.gb-fail)
Ülevaatuse aeg: tavaliselt 7–14 tööpäeva. Heakskiitmisel määratakse Addgene ID (nt #123456) ja plasmiid lisatakse avalikult andmebaasi.
Tulemus: plasmiidist saab globaalselt otsitav ressurss, mis on igale uurijale tasuta kättesaadav.
4. Valideerimisandmete standardne genereerimine ja üleslaadimine
Valideerimismeetodid: peavad vastama IWGAV-i (Rahvusvaheline antikehade valideerimise töörühm) viiele sambale:
|
Valideerimise tüüp |
meetod |
Nõuded |
|
Geneetiline valideerimine |
Sihtvalgu CRISPR-i knockout/knockdown |
WB-ribade kadumine või märkimisväärne vähenemine |
|
Ortogonaalne valideerimine |
Võrdlus massispektromeetria või RNA{0}}seq tulemustega |
Järjepidev väljendusmuster |
|
Sõltumatu antikehade valideerimine |
Rist{0}}valideerimine, kasutades erinevate epitoopidega antikehi |
Järjepidevad tulemused |
|
Funktsionaalne valideerimine |
Neutraliseerimisanalüüs, voolutsütomeetria |
Näitab eeldatavat bioloogilist funktsiooni |
|
Rakenduse valideerimine |
IHC, IF, WB, FC |
Spetsiifiline värvimine sihtrakenduse jaoks |
Andmevorming:
IHC/IF-pildid: peavad sisaldama negatiivset kontrolli (väljalülitatud kude) ja positiivset kontrolli.
WB-pildid: peavad sisaldama molekulmassi markereid ja sisemisi kontrolle (nt -aktiin).
Kõik pildid tuleb üles laadida kadudeta TIFF-vormingus koos katseparameetritega (antikehade lahjendussuhe, kokkupuuteaeg).
Kohustuslik nõue: kõik valideerimisandmed tuleb avaldada koos plasmiididega; kumbki pole asendamatu.
5. Ülemaailmne tasuta levitamine ja kasutamine
Juurdepääsu viis:
Külastage Addgene'i antikehade plasmiidide kollektsiooni
Otsige sihtantikeha (nt "OpenAb_SARS2_Spike")
Esitage mitte{0}}ärilise kasutamise leping (makset pole vaja)
Saate plasmiidi (tavaliselt 5–10 tööpäeva)
Kasutusjuhised:
Töös tuleb viidata Addgene'i ID-le ja originaaljärjestuse allikale.
Julgustage uute valideerimisandmete esitamist tagasi Addgene'i, et moodustada suletud ahelaga-ökosüsteem.
6. Pidev tagasiside ja ökosüsteemi iteratsioon
Andmete tagasiside mehhanism: kasutajad laadivad Addgene'i platvormile üles uued katsetulemused (nt uued rakendused, uute liikide reaktiivsus), moodustades dünaamilise valideerimise andmebaasi.
Kogukonna juhtimine: DSHB ja NIH avaldavad regulaarselt antikehade kvaliteediaruandeid, kõrvaldades ebaefektiivsed või ristreageerivad antikehad.
Tulemused: 2025. aasta seisuga saab 89% avatud lähtekoodiga antikehi kasutanud uuringutest iseseisvalt reprodutseerida, mis ületab kaugelt kaubanduslike antikehade 45%.
